徠卡倒置熒光顯微鏡

徠卡倒置熒光顯微鏡由于高分辨掃描電鏡的間世，為用表面標記技術(shù)觀察細胞表面形態(tài)和區(qū)別兩類紉胞群與其表面形態(tài)相的機能提供了條件。用此技術(shù)方法可研究細胞表面抗原、受體的性質(zhì)，分布及運動。在原則上，透射電鎊與熒光顯微鏡用的免疫標記技術(shù)也適用于免疫掃描電子顯微術(shù)。但由于徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡與透射電鏡的成像原理不同，因此對免疫掃描電境術(shù)的標記物有些特殊要求。這些要求是：

1．清晰、容易識別的形狀‘對透射電鏡的標記物要求電子致密度高，掃描電鏡的標記物電子密度不是重要問題，而形狀是識別的重要因素。

2．大小適宜：一般而言掃描電鏡分辨率低于透射電鏡，此外掃描電鏡標本要金屑鍍膜，這都影響樣品表面結(jié)構(gòu)的分辨。因此標記物若太小、結(jié)構(gòu)過于微細，就不能與樣品表面固有結(jié)構(gòu)區(qū)別，但標記物過于大，又不能明確定出去面抗原位置，因此標記物大小要兼顧以上兩方面。

3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在標本處理過程中不會被損壞品制備過程中能牢固地結(jié)合。

4.對細胞表面的固有親合力差。

符合以上條件的較常用的表面標記切有人工合成的非生物材料（膠乳顆粒，硅酸聚合物等），生物大分子（鐵蛋白，血藍蛋白等），病毒（1MV），噬茵體和肢體金顆粒等。

徠卡倒置熒光顯微鏡膠乳顆粒有聚苯乙烯和丙烯兩種*聚苯乙烯類顆粒表面疏水，易發(fā)生自聚集。但與抗體以適當比例混合時，不需偶聯(lián)便能很好地與抗體附著。丙烯類顆粒表面有oH基，自發(fā)聚集少。標記時可利用oH基進行偶聯(lián)。

如果樣品以苯乙烯樹脂做為包埋劑，徠卡倒置熒光顯微鏡再行割斷法做掃描電鏡觀察是十分方便的。因為苯乙烯聚合后，氧化丙烯及醋酸異戊酌等很容易將其溶解，多次更換溶劑便可將苯乙烯清除干凈。因此，在制做透射電鏡標本時，多做出幾個包埋膠囊樣品，待聚合后，按上述方法割斷，將割斷好的樣品放在氧化丙烯中，約2小時后便可經(jīng)酷酸異戊酷置換、臨界點干燥。

除樹脂割斷法外，徠卡倒置熒光顯微鏡尚有有機溶劑（酒糟、酷酸異戊圈等）割斷法；水溶性包埋劑（二甲基亞礬、甘油等）割斷法及其它（冷凍、氟里昂等）割斷法，操作都很容易。再以酒精割斷法為例：樣品固定后用酒精脫水，當脫水完成后，將樣品投入預(yù)先裝有無水乙醇的膠囊中（避免出現(xiàn)氣泡）。將膠囊放在低溫裝置內(nèi)使乙醇固化。進行樣品割斷。割斷的樣品立即進入置于室溫的無水乙醇中，待乙醇融化后移入醋酸異戊酷、進行臨界點干保。

徠卡倒置熒光顯微鏡硅酸聚合物顆粒為球形。使用時先加入Y一氨基三乙氧基丙硅烷（Y咆加n04r出hoxypr叩山1ane）使顆贛表面帶一NH3，然后再與抗體偶聯(lián)。

TMv長300nmp寬16nm助長桿狀結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下識別性好。能與18G牢固地結(jié)合，形成TMv一[8G復(fù)合物。如果紅細胞表面附有正常免[8G，TMv便能使這種紅細腦布滿桿狀物*由于該病毒過長使分辨率下降，也有實驗室將其截短使用。

常用的噬茵體是T4噬苗體（以大腸桿菌為宿主）有頭有尾，形如瞅助。在徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡下識別性能好。但體積較大，由x174也是以大腸桿菌為宿主的噬茵體，呈二十面體。因為體積較小，需用高倍觀察。

如果徠卡倒置熒光顯微鏡應(yīng)用高分辨率掃描電鏡．金標記是理想的。鐵蛋白雖然有高電子密度，但分子畢竟大小，因而應(yīng)用有限。

徠卡倒置熒光顯微鏡關(guān)于抗體的純化與透射電鏡所用的有關(guān)方法相同，抗體與標記物的偶聯(lián)也不在此贅述。

備注：徠卡倒置熒光顯微鏡，部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司，編輯整理上傳。